0571-87243172
發(fā)布于 2023-08-21
染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）是一種研究蛋白質(zhì)與染色質(zhì)DNA相互作用的技術(shù)，根據(jù)不同目的既可用于鑒定互作蛋白，也可用于鑒定互作DNA。通常被用于表觀遺傳學(xué)研究，如通過(guò)ChIP檢測(cè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)的組蛋白修飾。
操作步驟：
一、 樣品準(zhǔn)備（操作樣品在冰上或4℃進(jìn)行。）
對(duì)于懸浮細(xì)胞, 確保10 ml新鮮培養(yǎng)基中有合適數(shù)量的細(xì)胞，直接加37%甲醛至終濃度為1%。搖晃混勻后，室溫下?lián)u床孵育10 min。
對(duì)于組織, 液氮充分研磨組織至粉末狀。然后轉(zhuǎn)移至15 ml或50 ml尖底管中，加入10 ml PBS（Cat No. PR20023）和 270 μl 37%甲醛至終濃度為1%。搖晃混勻后，室溫下?lián)u床孵育10 min。
加入500 ul 2.5 M甘氨酸（至終濃度0.125 M）終止反應(yīng)，室溫孵育5 min。
細(xì)胞轉(zhuǎn)至50 ml尖底管中，4℃、2500 rpm離心5 min。
棄上清，冰預(yù)冷PBS（pH 7.4）洗滌細(xì)胞2次，每次洗滌后4℃、2500 rpm離心5 min。
用1 ml冰預(yù)冷細(xì)胞裂解液（Cat No. PR20001，現(xiàn)加蛋白酶抑制劑（Cat No. PR20016）），重懸細(xì)胞。為促進(jìn)細(xì)胞膜的破裂，用Douncer玻璃勻漿器勻漿細(xì)胞5~10次，4℃孵育15 min。
4℃、4000 rpm離心5 min，棄上清。
細(xì)胞裂解液重新細(xì)胞核 (每3-5 x 106 個(gè)細(xì)胞加100 ul裂解液)。
冰上超聲5~15 min(25%功率，超聲20s、停30s)，最佳超聲條件需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。
4℃、12000 rpm離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新EP管中，直接進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，或凍存-20℃?zhèn)溆谩?br />
二、DNA斷裂效果檢測(cè)
取50 ul染色質(zhì)上清，加入150 ul ddH2O，10 ul 5M NaCl，65 ℃ 4 h或過(guò)夜，解交聯(lián)。
加入RNaseA至終濃度50 μg/ml，37 ℃孵育30 min。
加入Proteinase K至終濃度50 μg/ml，42 ℃孵育30 min。
劑盒純化DNA片段。
1.5 %瓊脂糖膠電泳檢測(cè)。
三、免疫沉淀（按單個(gè)CHIP反應(yīng)）
準(zhǔn)備70 ul磁珠。
用600 μl含5 %BSA的PBS，洗滌磁珠2次。
第二次洗滌后，重懸磁珠至初始體積。
取100 ul細(xì)胞裂解物（約含20 ug 染色質(zhì)，具體因細(xì)胞及制樣不同而異），1:10稀釋至1 ml。
取25 ul洗好的磁珠，加至細(xì)胞裂解物中，進(jìn)行l(wèi)ysate 預(yù)吸附處理。
剩余45 ul磁珠，加入2-5 ug相應(yīng)抗體，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。（使用非特異性的IgG，作為陰性抗體對(duì)照）。
將步驟5 中樣品，磁性分離，轉(zhuǎn)移預(yù)吸附后的lysate至新EP管中。
用300 ul 冰預(yù)冷的 PBS（含5% BSA），洗滌步驟6后的抗體-磁珠復(fù)合物2次，棄上清。
加入預(yù)吸附后的lysate（留50 ul凍存?zhèn)溆茫┲量贵w-磁珠復(fù)合物中，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育2 h。
瞬離樣品，然后置于磁力架上。
每次1 ml低鹽洗滌液，洗滌2次。
每次1 ml高鹽洗滌液，洗滌2次。
每次1 ml LiCl洗滌液，洗滌2次。
每次1 ml TE溶液，洗滌2次。第2次洗滌時(shí)，轉(zhuǎn)移樣品至新EP管中。
最后洗滌結(jié)束，移液器盡棄洗滌液。
準(zhǔn)備Elution buffer，恒溫浴調(diào)至65 ℃。
加入100 ul Elution buffer至每個(gè)樣品中（步驟15后），65 ℃孵育10 min。
轉(zhuǎn)移洗脫液至新EP管，并重復(fù)步驟17一次，最終收集到200 ul。
取之前預(yù)吸附后的lysate 50 ul，作為 5% Input。補(bǔ)加150 ul Elution buffer，至總體積200 ul。
分別向CHIP洗脫樣品（步驟18后）和Input中加入10 ul NaCl（5 M 母液），65 ℃孵育過(guò)夜進(jìn)行解交聯(lián)。
四、DNA純化和分析：
加入Proteinase K至終濃度50 μg/ml，42 ℃孵育1 h。
試劑盒純化DNA片段。
PCR檢測(cè)及分析。